朱元璋率军攻打嵇康（今南京）时，马氏带领将士们的家属日夜不停地给将士们制作衣服和鞋袜；
战事紧张时，马氏自己也穿上军装，身先士卒，和士兵们一起冲锋陷阵，极大鼓舞了将士们的士气。
1368年正月，朱元璋于应天府（今南京）称帝，定国号为明，册立马氏为皇后。
马皇后虽贵为皇后，依然坚持亲自照料朱元璋的膳食，一为表示对皇上的敬意，二是使宫人们免于责罚，令宫人们感极而涕。
她在皇宫内眷中大力提倡节俭之风，命人把宫内丝绸织物的下脚料收集起来做成衣服给王妃公主们。
马皇后对嫔妃宫人特别优待，时常送食品衣物表示关心；对于功臣勋爵的家眷也十分体恤，经常送礼物以示皇恩；她还时常命人把旧衣服改造成被褥，送给孤苦无依的百姓。
马皇后心系子民，发现朝臣聚餐食物不可口，便建议太祖节省日常开支，以改善朝中贤能之士的伙食，太祖下令设立“红板仓”，专门负责给太学院的家人们提供粮食。
每逢灾荒年月，马皇后总是带领宫里人吃素、甚至吃粗麦饭野菜羹，以助祈祷上天降雨度过荒年。
她认为与其每次去救济灾荒，不如平时就预先积蓄储备。
马皇后曾多次巧妙劝谏朱元璋，使诸多臣民刑戮得以减免。
例如，参军郭景祥驻守和州时，有人说他的儿子持槊要杀父亲，太祖获悉后打算处死郭景祥的儿子，马皇后请朱元璋核实事件真实性，以免误杀致郭家绝后，太祖命人查访，果然是被冤枉的。
李文忠镇守严州时，杨宪诬告他有违法行为，太祖便要立即将其召回治罪，马皇后认为严州在敌境内，不易轻易撤换守将，且李文忠一向贤能，劝朱元璋不要轻信杨宪的话，太祖这才没将李文忠治罪，后来李文忠果然建立功勋。
翰林学士宋濂受其长孙宋慎牵连获罪，被逮捕至京城判以死刑，马皇后恳请朱元璋像普通百姓一样善待老师，朱元璋起初不肯听从，马皇后陪太祖吃饭时既不吃肉也不喝酒，称在为宋先生做福事，太祖听后顿觉伤感，放下筷子站起身，第二天便赦免了宋濂的死罪，将他安置在茂州。
明朝胡惟庸案始发于1380年，在马皇后干预下，朱元璋诛杀了一批人，但没有牵连太多；十年后胡惟庸案再起波澜，此时马皇后已经病逝，朱元璋大开杀戒，有3万多人因之遭到诛杀。
马皇后不仅保护了明朝开国功臣，同时也荫及了平民百姓，明初富可敌国的富豪沈万三，便得益于马皇后的护佑而免于一死。
1382年八月，马皇后患重病卧床不起，朱元璋遍寻天下名医为她诊治，但马皇后深知自己病重难医，唯恐朱元璋因自己服药后病情未好转而迁怒降罪于医生，故坚决不肯服药，当月便溘然长逝，享年五十一岁，九月庚午葬于孝陵，谥号“孝慈皇后”。
永乐元年（1403年），明成祖朱棣为马皇后上尊谥为“孝慈昭宪至仁文德承天顺圣高皇后”；嘉靖十七年（1538年），明世宗又尊奉为“孝慈贞化哲顺仁徽成天育圣至德高皇后”，是明代谥名最长的皇后。
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